圖：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所副研究員 涂濤
于北京召開(kāi)的第三屆飼料酶制劑科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展大會(huì)-青年論壇上，來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所的涂濤副研究員做了題為《基于體外分子進(jìn)化技術(shù)提高葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性和催化效率》的精彩報(bào)告。涂副研究員一直從事飼用酶相關(guān)的研究工作，綜合分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)，通過(guò)對(duì)飼用酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究，解決飼用酶性能差，無(wú)法滿足工業(yè)應(yīng)用需求這一根本性難題。目前已累計(jì)發(fā)表科研論文39篇，以主要完成人身份申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利17項(xiàng)（含PCT專利2項(xiàng)），其中獲得授權(quán)7項(xiàng)。
1． 研究背景
葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，Gox）作為一種新型的添加劑在飼料行業(yè)中受到廣泛關(guān)注，可用于預(yù)防動(dòng)物胃腸道感染、腹瀉，并有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)作用。飼用酶制劑應(yīng)用應(yīng)滿足耐飼料制劑高溫且在動(dòng)物溫下有高活性的條件，而Gox熱穩(wěn)定性差和催化效率低是限制其在飼料工業(yè)廣泛應(yīng)用的核心問(wèn)題。
2.研究進(jìn)展
涂副研究所在的團(tuán)隊(duì)以目前工業(yè)生產(chǎn)Gox最為常用的菌株Aspergillus niger為研究對(duì)象，首先利用根據(jù)Gox顏色反應(yīng)原理建立了畢赤酵母高表達(dá)菌株高效快速篩選方法，與傳統(tǒng)的篩選方法相比極大地提高了效率。接著，根據(jù)迭代突變的思路進(jìn)行了后續(xù)的分子進(jìn)化研究。從比活較野生型提高了1.1倍的突變體M1到提高2.81倍的突變體M4,這個(gè)過(guò)程應(yīng)用了隨機(jī)突變和理性設(shè)計(jì)結(jié)合的思路方法，其中理性設(shè)計(jì)中涉及了蛋白表面的優(yōu)化、增強(qiáng)疏水堆積力、替換熱不穩(wěn)定氨基酸（Asn）等策略。除了比活大幅提高之外，Gox的熱穩(wěn)定性也得到了極大地改善，在60℃下孵育120min，M4較野生型提高了約55%（86.2% VS 31。7%），在70℃下孵育30min，M4較野生型提高了37%（40.3% VS 3.1%），且突變體M4在70℃下的酶活為野生型的11.5倍。在M4的基礎(chǔ)上又對(duì)耐熱Gox進(jìn)一步升級(jí)，利用糖基化修飾、疏水作用力、增強(qiáng)輔基結(jié)合力和鹽橋作用力策略達(dá)到了80℃處理2min剩余80%酶活的效果，較M4提高了40%，完全滿足于應(yīng)用成產(chǎn)的需求，實(shí)現(xiàn)了技術(shù)轉(zhuǎn)讓4項(xiàng)次，金額達(dá)580萬(wàn)元。
該研究一方面為Gox結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系探討提供了有用信息，更為擴(kuò)展Gox的實(shí)際應(yīng)用提供了有用素材。
