圖：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院博士 夏旻灝
在北京召開(kāi)的第三屆飼料酶制劑科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展大會(huì)-青年論壇上，來(lái)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)夏旻灝博士做了題為《基于限制性酶解技術(shù)制備免疫活性肽及其作用機(jī)理研究》的精彩報(bào)告。
限制性酶解技術(shù)是一種因果導(dǎo)向型的體外酶解技術(shù)，其以明確功能的酶解產(chǎn)物或酶解后整體效果預(yù)期為導(dǎo)向，在體外可控條件下，進(jìn)行底物、酶和反應(yīng)條件的限制，使得酶解產(chǎn)物產(chǎn)量或酶解后整體效果達(dá)到預(yù)期。本次報(bào)告以免疫活性肽的開(kāi)發(fā)為實(shí)例，首先基于文獻(xiàn)查閱，發(fā)現(xiàn)脾臟、胸腺、淋巴結(jié)等免疫器官或組織中含有一定量的免疫活性肽或免疫活性肽前體，進(jìn)而通過(guò)概略養(yǎng)分分析和氨基酸組成分析，結(jié)果可見(jiàn)，脾臟的干物質(zhì)、粗蛋白均顯著高于其余二者（P＜0.05），粗脂肪、粗灰分均顯著低于其余二者（P＜0.05）；再通過(guò)米氏常數(shù)比較酶解用酶的親和性，其中在以脾臟凍干粉為底物時(shí)，枯草芽孢桿菌蛋白酶的米氏常數(shù)=0.48，數(shù)值最低，反應(yīng)效率最高；進(jìn)而通過(guò)PB設(shè)計(jì)甄別關(guān)鍵因變量和主效參量，結(jié)果表明，在以酶解小分子肽產(chǎn)量為因變量時(shí)，模型最為貼合實(shí)際，其中料液比、pH、枯草芽孢桿菌蛋白酶酶活為主效參量；通過(guò)RSM優(yōu)化上述3者，獲得最佳反應(yīng)條件，并獲得最高酶解小分子肽產(chǎn)量，其中2-10肽含量為70.7%，詳見(jiàn)，F(xiàn)ig 1:
Fig 1. （A）PB設(shè)計(jì)帕累托圖；（B）RSM 3D擬合圖；（C）GPC色譜圖。
通過(guò)BALB/c小鼠構(gòu)建免疫抑制模型，結(jié)合評(píng)估酶解脾肽的免疫活性，結(jié)果表明，酶解脾肽可顯著增加免疫抑制BALB/c小鼠的CD4+、CD8+和B淋巴細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05），詳見(jiàn)，F(xiàn)ig 2:
Fig 2. （A）空白對(duì)照；（B）空白對(duì)照基礎(chǔ)，每日灌胃50mg/kg酶解脾肽；（C）免疫抑制小鼠；（D）免疫抑制基礎(chǔ)，每日灌胃12.5mg/kg酶解脾肽；（E）免疫抑制基礎(chǔ)，每日灌胃25mg/kg酶解脾肽；（F）免疫抑制基礎(chǔ)，每日廣為50mg/kg酶解脾肽；（G）溶血空斑試驗(yàn)；其中，第一象限為CD4+細(xì)胞、第二象限為CD8+細(xì)胞，不同字母標(biāo)示組間差異顯著，P＜0.05。
酶解脾肽可顯著改善胸腺的形態(tài)并提高重量，顯著提高脾小體面積和脾臟重量（P＜0.05），顯著改善腸道形態(tài)（P＜0.05），顯著提高脾臟、胸腺、空腸的TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12等細(xì)胞因子的蛋白分泌量（P＜0.05）；通過(guò)超濾膜分離和液相色譜分離，可分為十個(gè)峰，其中峰6、7能顯著提高RAW264.7細(xì)胞活力（P＜0.05），其中峰6、7的主要成分為MrRESP-1=645.7, MrRESP-2=357.5，詳見(jiàn)，F(xiàn)ig 3:
Fig 3. （A）分離液相色譜圖；（B）RAW264.7細(xì)胞活力測(cè)定（CCK-8）；（C）RESP-1 LC-MS色譜圖；（D）RESP-2 LC-MS色譜圖；其中，不同字母標(biāo)示組間差異顯著P＜0.05。
通過(guò)LC-MS純化并于RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行活性驗(yàn)證，結(jié)果表明RESP-1, RESP-2均能激活RAW264.7細(xì)胞的免疫活性，顯著提高RAW264.7細(xì)胞一氧化氮合酶酶活（P＜0.05），并顯著提高總NO產(chǎn)量（P＜0.05）。綜合可見(jiàn)限制性酶解技術(shù)具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值，并于生物活性飼料添加劑的研發(fā)領(lǐng)域具有廣闊的前景。
